<855> 散射光濁度法和透射光比濁法

1.     介紹

散射光濁度法和透射光比濁法是基于光散射現(xiàn)象原理的分析技術(shù)。光散射是一種物理現(xiàn)象，其中光束由于與足夠小的物質(zhì)粒子相互作用而改變其傳播方向（稱為偏轉(zhuǎn)）。根據(jù)麥克斯韋電磁理論，散射發(fā)生的先決條件是懸浮顆粒的折射率必須不同于懸浮液體的折射率。差異越大，散射越強(qiáng)烈。光散射有兩種類型：1）彈性散射，其中散射光和入射光的波長(zhǎng)相同；2）非彈性光散射，其中散射光和入射光的波長(zhǎng)不同。只有第一種光散射（彈性）與散射光濁度法和透射光比濁法有關(guān)。

在透射光比濁法中，測(cè)量透射光的強(qiáng)度，并在入射光方向（即0°）測(cè)量散射導(dǎo)致的入射光強(qiáng)度的衰減，并與入射光強(qiáng)度進(jìn)行比較（空白測(cè)量）。被測(cè)特性是懸浮顆粒散射效應(yīng)的間接測(cè)量，稱為濁度。懸浮樣品對(duì)光的任何吸收都會(huì)導(dǎo)致光強(qiáng)度的額外衰減（參見(jiàn)<857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy和<1857> Ultraviolet-Visible Spectroscopy—Theory and Practice）。因此，確保被測(cè)材料不會(huì)吸收測(cè)量波長(zhǎng)處的光非常重要。實(shí)際上，控制吸收和濁度測(cè)定的方程式是相同的（盡管衰減常數(shù)的值不同）。在散射光濁度法中，測(cè)量與入射光傳播方向成90°角的散射光強(qiáng)度。因此，散射光濁度法濁度測(cè)量是對(duì)懸浮物散射效應(yīng)的直接測(cè)量。

2. 術(shù)語(yǔ)和定義

描述濁度法和濁度法的常用術(shù)語(yǔ)包括：

•濁度（符號(hào)S）：由于懸浮顆粒的光散射效應(yīng)，透射入射光束強(qiáng)度降低的一種度量。懸浮物的量可以通過(guò)觀察透射光（比濁法）或散射光（濁度法）來(lái)測(cè)量。

log I₀/I_t = kbc = T

I₀=入射光強(qiáng)度

I_t=透射光強(qiáng)度

k=摩爾濁度系數(shù)

b=樣品池路徑長(zhǎng)度

c=濃度

T=濁度

•濁度（符號(hào)，τ）：在透射光濁度測(cè)量中，濁度是給定懸浮液的入射光束強(qiáng)度/單位長(zhǎng)度減少的量度。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織將濁度定義為“由于存在未溶解物質(zhì)而導(dǎo)致液體透明度降低"。

•濁度測(cè)量單位：渾濁度單位用一個(gè)描述符表示，該描述符指示測(cè)量方法。

•散射光濁度計(jì)濁度單位（NTU）：當(dāng)使用散射光濁度法測(cè)量濁度時(shí)，濁度計(jì)以與入射光傳播方向成90°角的角度測(cè)量散射光，濁度單位稱為散射光濁度法濁度單位（NTU）。NTU的大小是根據(jù)初級(jí)福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)品（一種將硫酸肼和六亞甲基四胺溶液混合在水中制成的懸浮液）產(chǎn)生的濁度定義的。更安全的聚合物微珠懸浮液現(xiàn)已上市，并被*為可接受的替代品。然而，所有這些標(biāo)準(zhǔn)都可以追溯到福爾馬肼。初級(jí)福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)溶液的濁度為4000 NTU。

其他*的濁度單位包括福爾馬肼比濁法單位（FTU）和福爾馬肼濁度法單位（FNU）。這些單位相當(dāng)于0-40 NTU范圍內(nèi)的NTU。

3.     應(yīng)用

透射光比濁法和散射光濁度法技術(shù)的應(yīng)用包括1）溶液和/或懸浮液的濃度測(cè)定（通過(guò)在控制良好的反應(yīng)參數(shù)下沉淀和懸浮產(chǎn)生的沉淀物，來(lái)測(cè)定幾種陽(yáng)離子和陰離子）；2）測(cè)量混濁溶液或懸浮液的濁度；3）測(cè)定分子量在1000到數(shù)億之間的多分散體系的重均分子量和尺寸；4）測(cè)量免疫分析的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)或免疫沉淀動(dòng)力學(xué)（比率散射濁度法）；5）監(jiān)測(cè)細(xì)胞和細(xì)菌的生長(zhǎng)；6）懸浮物粒度分布測(cè)定、顆粒計(jì)數(shù)等。

比率散射濁度法廣泛用于疫苗成分分析和/或血清成分的定量。它還用于重組生物制藥中的宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定。當(dāng)使用該技術(shù)時(shí)，通過(guò)測(cè)量抗原-抗血清或抗原純化抗體復(fù)合物的光散射反應(yīng)的變化，來(lái)計(jì)算導(dǎo)致免疫抗體-抗原沉淀反應(yīng)或凝集反應(yīng)的抗原（Ag）或抗體（Ab）的量。通常考慮抗原共價(jià)連接或吸附在聚合物微球上，以提高散射效率；由此產(chǎn)生的技術(shù)被稱為“顆粒增強(qiáng)免疫分析"。雖然這項(xiàng)技術(shù)被稱為散射光濁度法，但通常散射光和透射光都是用比率儀器測(cè)量的。

散射光法濁度測(cè)量在低濁度范圍（散射介質(zhì)濃度相對(duì)較低）更可靠。在該范圍內(nèi)，觀察到樣品濃度與檢測(cè)器信號(hào)強(qiáng)度（以NTU表示）之間存在線性關(guān)系。隨著濃度的增加，多次散射的入射角也會(huì)增加，從而偏離線性響應(yīng)。支持可靠線性關(guān)系的最大NTU值在1750–2000 NTU范圍內(nèi)。透射光比濁法適用于更高的濁度范圍（散射介質(zhì)的濃度）。為了獲得一致的結(jié)果，必須仔細(xì)控制所有測(cè)量變量。在可能的情況下，可以測(cè)量極稀的懸浮液。

4. 儀器儀表

用于透射光比濁法和散射光濁度法測(cè)量的儀器分別稱為透射光濁度計(jì)和散射光濁度計(jì)。通常，這些儀器包括一個(gè)帶有濾光器的汞燈（用于強(qiáng)綠線或藍(lán)線）、一個(gè)快門、一組具有已知透射率的中性濾光器和一個(gè)靈敏的光電倍增管，該光電倍增管可安裝在與入射光傳播方向成0°或90°角的位置，或者在一個(gè)臂上，它可以圍繞溶液?jiǎn)卧D(zhuǎn)，并通過(guò)不透光外殼外的表盤設(shè)置為?135°到0°到+135°的任何角度。溶液池的形狀多種多樣，例如用于測(cè)量90°散射的正方形；45°、90°和135°散射為半八角形；圓柱形可適用于所有角度的散射（見(jiàn)圖1）。

圖1.代表性濁度儀。注意，探測(cè)器2可安裝在可移動(dòng)臂上。

濁度也可以用標(biāo)準(zhǔn)光電濾光光度計(jì)或分光光度計(jì)測(cè)量，最好是在光譜的藍(lán)色部分進(jìn)行照明。散射光濁度法測(cè)量需要一個(gè)裝有光電管的儀器，以便接收散射光，而不是透射光。由于這與熒光計(jì)中使用的幾何結(jié)構(gòu)相同，因此可通過(guò)適當(dāng)選擇濾光片將其用作濁度計(jì)。比率濁度計(jì)結(jié)合了90°散射光濁度法和透射光比濁法。它包含光電管，接收和測(cè)量與樣品成90°角的散射光，以及接收和測(cè)量樣品前面的前向散射光。它還測(cè)量直接穿過(guò)樣品的光。通過(guò)90°角散射光測(cè)量值，前向散射光測(cè)量值和透射光測(cè)量值之和，計(jì)算兩者的比值，可獲得線性度。使用比率濁度測(cè)量系統(tǒng)的好處是雜散光的測(cè)量變得可以忽略不計(jì)。此外，彩色懸浮液的濁度測(cè)定僅使用透射光比濁法濁度儀或濁度儀（帶比率模式）進(jìn)行，因?yàn)樵摮绦蜓a(bǔ)償了懸浮液顏色導(dǎo)致的光衰減。通常，這些儀器中的光源是鎢燈，在2700 K的燈絲溫度下工作，大部分光強(qiáng)約為550 nm。也可使用其他合適的光源。通常，探測(cè)器是▲硅二極管▲和光電倍增管。另一種消除顏色效應(yīng)的方法是使用紅外發(fā)光二極管作為光源，其最大發(fā)射中心約為860 nm，光譜帶寬為60 nm。當(dāng)激光光源也被使用時(shí)，尤其是在濁度測(cè)量?jī)x器中，這種技術(shù)通常被稱為“激光濁度測(cè)量"。使用激光散射光濁度計(jì)的優(yōu)點(diǎn)是，在非常低的檢測(cè)水平下，信噪比顯著提高。通常光源是工作波長(zhǎng)為660 nm的激光二極管。激光束的高功率密度使較小粒子產(chǎn)生更高的散射強(qiáng)度。與吸收未散射光的光阱相結(jié)合，該系統(tǒng)可顯著降低雜散光。當(dāng)專著中的某個(gè)程序指示使用散射光濁度計(jì)或透射光濁度計(jì)時(shí)，可以使用在比率模式下工作的儀器。

5. 福爾馬肼濁度標(biāo)準(zhǔn)

福爾馬肼是目前已知的主要濁度標(biāo)準(zhǔn)。所有其他標(biāo)準(zhǔn)都是次要的，必須追溯到福爾馬肼。 主要標(biāo)準(zhǔn)在▲IUPAC Compendium of Chemical Terminology▲（ERR 1-May-2019）第 2 版（金書）中被定義為由用戶使用明確定義的方法和條件從可追溯的材料準(zhǔn)備的標(biāo)準(zhǔn)。

福爾馬肼懸浮液有許多特點(diǎn)，以確保其適合作為主要標(biāo)準(zhǔn)。它可以從試劑級(jí)的起始材料中始終如一、準(zhǔn)確地制備。該懸浮液由不同長(zhǎng)度和隨機(jī)構(gòu)型的聚合物組成，其組成的聚合物的形狀和尺寸從小于0.1 μm到大于10 μm不等。盡管聚合物鏈長(zhǎng)分布已被證明因制備而異，但總的濁度結(jié)果是可以很好地重現(xiàn)的。

5.1 Preparation of the Formazin Standards 福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液的制備

•硫酸肼溶液：將1.000 g ACS級(jí)硫酸肼（N₂H₄·H₂SO₄）溶解在100 mL 的A類容量瓶中中，并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度。讓該溶液靜置4-6小時(shí)。

•初級(jí)福爾馬肼標(biāo)準(zhǔn)液：將2.50 g分析級(jí)六亞甲基四胺[(CH₂)₆N₄]溶于25.0 mL無(wú)顆粒水中，裝入100 mL燒瓶。使用A類25 mL移液管加入25.0 mL硫酸肼溶液，并充分混合。使用前，讓制劑在25±1°的溫度下靜置48小時(shí)。由此產(chǎn)生的懸浮液可穩(wěn)定運(yùn)行2個(gè)月。

•福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液1：使用15 mL A類移液管，將15 mL福爾馬肼初級(jí)標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)移至1 L容量瓶中，并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為60 NTU。

•福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液2：使用50 mL A類移液管，將50 mL福爾馬肼初級(jí)標(biāo)準(zhǔn)液轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，并用無(wú)顆粒水稀釋至刻度并混合。所得懸浮液的濁度為1000 NTU。

•福爾馬肼參考懸浮液：根據(jù)表1，在100 mL容量瓶中混合各份福爾馬肼儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)懸浮液和無(wú)顆粒水，制備福爾馬肼參考懸浮液。